从双抗技术难点剖析“为什么双抗研发看平台”（下篇）

作者:药链

本篇将结合上篇梳理的双抗药物研发过程的技术难点，聚焦解读双抗药物研发的典型技术平台。双抗分子根据是否具有Fc区可以分为全长双抗和片段双抗，其技术平台因此可分全长双抗技术平台和片段双抗技术平台两大类。虽然两类平台开发的双抗分子各具特色，但是无论哪一种平台，核心都是突破双抗分子成药性差和产业效率低的技术障碍。图：全长双抗和片段双抗相关平台本文将结合前文梳理的双抗体药物研发中的技术难点，重点解读双抗体药物研发的典型技术平台。双抗体分子根据是否有Fc区可分为全长双抗体和片段双抗体，因此其技术平台可分为全长双抗体技术平台和片段双抗体技术平台。虽然两个平台开发的双抗体分子各有特色，但无论是哪个平台，核心都是突破双抗体分子成药性差、产业化效率低的技术壁垒。图:全长双抗体和片段双抗体相关平台

 片段双抗体的典型技术平台

常见的商业化技术平台包括Amgen的BiT、赛诺菲的Bi-Nanobody、MacroGenics的DART、Affimed的TandAb等。这类平台最大的相似之处是开发的双抗体分子没有Fc区，分子量相对较小，半衰期短等常见问题；最典型的区别是有不同的抗体模块串联，如抗原结合片段(Fab)、纳米体(VHH)、单链抗体(ScFv)等。，例如，BiT使用单链抗体，Bi-Nanobody使用纳米体。

1。BiTE技术平台

BiTE技术平台最初由Micromet公司研发，2012年被安进以12亿美元收购。这是一种串联单链抗体技术平台，通过易弯曲的肽段linker将两个单链抗体（ScFv）以串联的方式连接在一起，防止链内VH结构域和VL结构域配对，以此控制和减少杂质蛋白，提高表达量，肽段linker的存在也改善了单链抗体稳定性差、溶解性低等生产问题；但半衰期依然较短，小于2小时。基于BiTE开发的双抗药物Blinatumomab已经在2014年上市。图：Blinatumomab作用机制BiT技术平台最初由Micromet开发，2012年被Amgen以12亿美元收购。这是一个串联单链抗体技术平台。两个单链抗体(ScFv)通过柔性肽接头串联在一起，防止链中的VH结构域和VL结构域配对，从而控制和减少杂质蛋白，提高表达水平。肽接头的存在也改善了单链抗体的稳定性差、溶解性低等生产问题。但是半衰期还是很短，不到2小时。Blinatumomab是在BiTE的基础上开发的双重抗药，于2014年上市。图:Blinatumomab动作机制

目前，Amgen正在广泛探索BiT技术平台的潜力。在产品管道储备方面，基于BiT技术平台的临床研究有10余项。在平台开发上，安进开发了基于BiTE的新一代双防技术平台HLE BiTE。将Fc片段融合到原始BiT分子结构上，获得了物理化学稳定性更强、半衰期更长的双抗体分子。

2。DART技术平台

DART技术平台是由MacroGenics和Servier联合开发的双抗体构建技术。基于此平台开发的双抗体分子是由两条多肽链结合形成的异二聚体抗体。构建的基本原理是将一个抗体可变区的VH和VL序列与另一个抗体可变区的VL和VH序列连接起来，在两条多肽链的C端引入半胱氨酸，通过半胱氨酸在链间形成二硫键，从而提高分子稳定性。另外，一个肽的线圈含有带负电荷的谷氨酸残基，另一个肽含有带正电荷的赖氨酸残基，通过吸引不同的电荷促进异二聚体的形成。此外，在基本DART分子中加入FC片段可以将半衰期从几个小时增加到几天和几周。

基于该技术平台合作的双抗项目较多，强生、辉瑞等跨国企业均与之达成合作关系，国内企业再鼎医药也与MacroGenics公司正在共同开发3款双抗药物。图：DART分子构建基于这个技术平台的双抗体项目很多，强生、辉瑞等跨国企业与之达成了合作关系。国内企业再鼎医药和宏基因也在联合研发三种双抗体药物。图:灾难援助反应队分子结构

3。bi-na无名之辈 技术平台

Bi-Nanobody技术平台最初由Ablynx公司开发，2018年被赛诺菲收购，总价48亿美元。该平台开发的产品是参比骆驼和骆马的单结构域抗体结构，缺失轻链的重链抗体可变区片段，也称为纳米体(VHH)，连接两个或多个VHH，实现多特异性结合。这类产品的主要优点是分子小、稳定性高、易人源化、易连接、易穿透深层组织并靶向一些正常IgG抗体难以到达的表位，可通过多种途径给药。虽然由于缺乏Fc区，体内循环半衰期较短，但通过融合人血清白蛋白或白蛋白功能区，半衰期可延长至2-3周。代表药物是Ablynx公司开发的三价双特异性纳米抗体Ozoralizumab。

全长双抗体典型技术平台

全长双抗体技术平台开发的双抗体分子都具有相对完整的Fc区，根据双抗体分子的结构对称性可以进一步分为对称模式和不对称模式。

对称模式双抗体:两个特异性不同的抗原结合域融合在单个多肽链或单组成对轻、重链中，保留了更接近天然抗体但大小和结构不同的Fc区。代表性平台包括雅培的DVD-Ig技术平台和罗氏的二合一技术平台。

1。 DVD-IG 技术平台

DVD-Ig技术由雅培开发，其结构是在正常IgG抗体轻链和重链的N末端分别再接入另一个抗体的VL和VH结构域，产生一个对每个抗原各有两个结合位点的四价分子，通过两个可变区结合双靶点来实现双功能。这个技术可以避免不同的重链或轻链的错配，同时提高生产的重复性、产量和稳定性。由于DVD-Ig双抗与正常单抗具有相同的Fc区，可以采用现有通用抗体技术进行生产。但是因为可变区结合了另一个抗体的VL和VH结构域，可变区内部的亲和力有降低的潜在风险。类似的技术还有在正常抗体IgG上连接scFv，或者将scFv连接在CL末端或CH3末端，产生了一系列双抗结构结构。图：DVD-Ig双抗分子图示DVD-Ig技术是由Abbott开发的，其结构是将另一种抗体的VL和VH结构域分别插入正常IgG抗体轻链和重链的N端，产生一个四价分子，每个抗原有两个结合位点，通过两个可变区与两个靶标结合实现双重功能。该技术可以避免不同重链或轻链的错配，提高生产的重复性、产量和稳定性。由于DVD-Ig双抗体与正常单克隆抗体具有相同的Fc区，因此可以用现有的通用抗体技术生产。然而，因为可变区与另一种抗体的VL结构域和VH结构域结合，所以存在可变区内亲和力降低的潜在风险。类似的技术包括将单链抗体连接到正常抗体IgG上，或者将单链抗体连接到C1端或CH3端，从而产生一系列双抗体结构。图片:DVD-Ig双抗体分子图

2。二合一 (DAF)技术平台

Two-in-one技术最早由基因泰克提出，通过对抗体分子可变区进行工程化改造并通过噬菌体展示技术获得识别两个不同靶点的双特异抗体，又称为DAF抗体。DAF抗体有双抗原结合位点，抗体本身能结合的靶抗原为第一个抗原，在抗原结合区引入突变可以识别第二个抗原。DAF抗体具有正常IgG抗体的结构，稳定性良好，易于进行产业化生产，在下游生产工艺、制剂开发和体内药动学等方面具有突出的优势，技术难点在于前期的工程化过程。图：DAF抗体构建图示二合一技术最早由基因泰克提出。双特异性抗体，又称DAF抗体，是通过对抗体分子可变区的工程改造和噬菌体展示技术获得的。DAF抗体具有双抗原结合位点，抗体本身能结合的靶抗原是第一抗原，引入抗原结合区的突变能识别第二抗原。DAF抗体具有正常的IgG抗体结构，稳定性好，易于工业化生产，在下游生产工艺、制剂开发和体内药代动力学等方面具有突出优势。技术难点在于前期工程流程。图:DAF抗体结构图

【/s2/】不对称模式的双抗体数量比对称模式多，有些采用类似于天然抗体的结构，以尽可能保留天然抗体的优势。大多数不对称模式是基于共表达四条或三条多肽链时促进重链异二聚化或轻链和重链正确配对的策略而发展起来的，因此链相关问题是这类平台要解决的关键技术问题。代表性平台包括罗氏的KiH技术平台和ART-Ig技术平台。

1。打结技术 (kih)技术

KiH技术由基因泰克于1997年开发，目前已过专利期，作为双抗基础平台，常与其他技术结合形成新的平台。该技术的基础原理是将双抗一条重链上CH3区的一个体积较小的苏氨酸突变为体积较大的酪氨酸，形成突出的“Knobs”型结构，同时将另一条重链上CH3区的一个较大的酪氨酸残基突变成较小的苏氨酸，形成凹陷的“holes”型结构，利用“KiH”结构的空间位阻效应实现两条不同重链间的正确装配。该技术使双抗重链的正确装配率达90%-95%，可以达到规模化生产的要求。但经过突变后的抗体分子稳定性不如天然抗体，往往需要引入链间二硫键稳定抗体结构。图：Knobs-into-Holes（KiH）技术图示KiH技术是基因泰克在1997年开发的，已经过了专利期。【/s2/】作为双抗体的基础平台，常与其他技术结合形成新的平台[/s2/】。该技术的基本原理是将一条重链的CH3区较小的苏氨酸突变为较大的酪氨酸，形成突出的“Knobs”结构，同时将另一条重链的CH3区较大的酪氨酸残基突变为较小的苏氨酸，形成凹陷的“空穴”结构。【/s2/】利用“KiH”结构的空间效应实现两个不同重链之间的正确组装【利用该技术，双抗体重链的正确组装率可达90%-95%，可满足大规模生产的要求。但突变抗体的分子稳定性不如天然抗体，因此往往需要引入链间二硫键来稳定抗体结构。图:旋钮入孔(KiH)技术图

2。ART-Ig技术平台

ART-Ig技术由罗氏子公司Chugai开发，采用CH3静电转化原理。所谓静电修饰，主要是利用生理条件下带有不同电荷的氨基酸来设计的。生理条件下，赖氨酸、精氨酸、组氨酸带正电荷，天冬氨酸、谷氨酸带负电荷。该技术用带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸取代一条重链CH3区的一个残基，用带正电荷的赖氨酸取代另一条重链CH3区的一个残基。基于“同种电荷相互排斥，相反电荷相互吸引”的原理，可以阻止同种重链形成二聚体，促进异二聚体的形成。

罗氏在ART-Ig技术的基础上升级开发了FAST-Ig技术。基于重链CH3中正负电荷的修饰，在重链CH1和轻链C1中引入正负电荷以解决轻链错配问题。

除了罗氏，很多药企也有自己的静电突变专利技术。例如，安进将一条链上不同于罗氏的K329D和K409D以及另一条链上的E356K和D399K指定为突变位点，以防止两种抗体的分子链错配。【/s2/】国内企业优智优生物制药有限公司也通过电荷突变降低双抗体分子重链错配，进一步降低同二聚体与KiH突变的错配[/s2/】。

【/s2/】总结:【/s2/】由于双抗体分子的多样性和特殊性，经过多年的积累，双抗体技术取得了长足的进步，各种企业的各种平台如火如荼，各有利弊。随着双反技术的不断发展，更具优势的平台技术值得进一步研究和优化。

参考文献:

1.“双特异性抗体行业深度报道:抗体V2.0曙光初现，聚焦肿瘤领域”

2.2020年中国双特异性抗体产业投资机会分析

3.2020年中国双特异性抗体产业综述

4.“双特异性抗体平台的行业领导者”

5.“刘悦:开发双特异性抗体的关键和难点”

6.“双特异性抗体药物的研究|技术概述”